Muhamad Nahrowi
mengutip dari Septiani Martha1, Adek Zamrud Adnan2, Erjon1
2Fakultas Farmasi Universitas Andalas, Padang
ISOLASI SENYAWA FLAVANON DARI DAUN SIRSAK
(Annona muricata
L.) DAN UJI ANTIOKSIDAN DENGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI DAN PEREAKSI DPPH
Septiani Martha1, Adek Zamrud Adnan2,
Erjon1
2Fakultas Farmasi Universitas Andalas, Padang
Email
address: Thatha39martha@yahoo.com
ABSTRAK
Telah diisolasi senyawa flavanon dan uji antioksidannya dari daun sirsapk (Annona muricata L.) dengan metode
spektrofotometri dan pereaksi DPPH. Proses isolasi dilakukan secara maserasi,
kemudian difraksinasi dengan n-heksan, diklormetana, diklormetana basa, etil
asetat. Pada pemeriksaan komponen dengan kromatografi lapis tipis,
spektrofotometri (UV dan IR) dan aktivitas antioksidan dengan menggunakan
spektrofotometri radikal bebas DPPH, dari hasil penelitian diperoleh pola
spektrum UV didapatkan puncak pada panjang gelombang maksimum 223 nm dan 279,5
nm, sedangkan hasil spektrum IR menunjukan adannya gugus OH, gugus C-H, gugus
C=O, gugus C=C, gugus C-O. Pengujian antioksidan senyawa hasil isolasi
didapatkan IC50 sebesar 25,6 ppm sedangkan IC50 dari
senyawa pembanding vitamin C sebesar 23,25ppm. Berdasarkan pengujian dengan
pereaksi flavonoid, data spektrum UV dan IR, komponen tersebut diduga senyawa
flavanon dan mempunyai aktivitas antioksidan.
Kata Kunci :
Flavanon, Annona muricata, Antioksida
ABSTRACT
An antioxidant flavanon of Sirsak leaves has been isolated. The isolation
process is done by maceration, then fractionated by n-hexane, diklormetana,
diklormetana base, and ethyl acetate. The identification of compounds used
thin-layer chromatography, spectrophotometri (UV & IR) and antioxidant
activity by DPPH methode. From the experimens showed UV spectra give wavelength
223 nm and 279,5 nm and spectra have he the presence of OH, C-H, C=O, C=C, and
C-O bond. The spectrophotometry examination of antioxidant activity from
isolated compound obtained IC50 = 25,6ppm, while IC50 of
literature in 23,25ppm.as comparation. Based on examination with flavonoid
reagen and data of UV and IR spectra, this compound supposed as flavanon and has the antioxidant
activity.
Keywords
: Flavanon, Annona muricata, Antioxidant
PENDAHULUAN
Radikal bebas bersifat reaktif, dan
jika tidak diinaktifkan akan dapat merusak makromolekul pembentuk sel, yaitu
protein, karbohidrat, lemak, dan asam nukleat, sehingga dapat menyebabkan
penyakit degeneratif. Pada penelitian lebih lanjut telah diteliti bahwa sekitar
40 penyakit mencakup aterosklerosis, hipertensi, iskemik, alzheimer, parkinson,
kanker dan peradangan disebabkan oleh radikal bebas (Youngson, 2005).
Kerusakan oksidatif atau kerusakan
akibat radikal bebas dalam tubuh pada dasarnya dapat diatasi oleh antioksidan
endogen seperti enzim katalase, glutathione
peroxidase, dan superoxide dismutase.
Namun jika senyawa radikal bebas terdapat berlebih dalam tubuh atau melebihi
batas kemampuan proteksi antioksidan seluler, maka dibutuhkan antioksidan
tambahan dari luar atau antioksidan eksogen untuk menetralkan radikal yang
terbentuk. Antioksidan memiliki kemampuan menghambat, menangkap dan mencegah
pembentukan radikal dengan cara memutuskan reaksi berantai sehingga tidak
terjadi kerusakan, selain itu antioksidan juga bekerja memperbaiki sel-sel dan
jaringan yang rusak karena serangan radikal bebas (Youngson, 2005).
Berdasarkan referensi ilmiah,
diinformasikan bahwa daun sirsak diklaim mempunyai potensi antikanker 10.000
lebih kuat dibandingkan obat antikanker konvensional seperti doxorubisin
(Mclaughin, 2008). Adapun senyawa yang berperan adalah senyawa sitotoksik
seperti senyawa golongan acetogenin, alkaloid isoquinolin, serta alkaloid
swainsonin. Selain itu, diinformasikan juga dari alkaloid swainsonin yang
terkandung pada daun sirsak, memiliki efek samping neurotoksin yang menyebabkan
gangguan bergerak (penyakit parkinson) (Mohanty, et al., 2007). Selain memiliki aktivitas antikanker, daun sirsak
juga memiliki aktivitas antioksidan, adapun senyawa berperan adalah golongan
senyawa fenolik seperti asam fenolat, asam kafeat, asam p-kumarat, asam ferulat
(Ideasanti, 1995).
Berdasarkan informasi dan referensi
yang didapat, peneliti ingin mencari fraksi dari daun sirsak yang tidak
memiliki kandungan alkaloid berbahaya yang diduga alkaloid swainsonin sehingga
aman dan efektif digunakan untuk pengobatan, memiliki aktivitas antioksidan
yang kuat serta masih memiliki aktivitas antikanker sehingga dapat menghambat
pembentukan sel kanker.
Penelitian ini dilakukan dengan
pendekatan fitokimia dan pendekatan farmakologi, pendekatan fitokimia dilakukan
dengan mengidentifikasi metabolit sekunder dari berbagai fraksi ekstrak dan
memisahkan fraksi yang mengandung alkaloid yang diduga alkaloid swainsonin
dengan pengujian menggunakan kromatografi lapis tipis. Sedangkan pendekatan
farmakologi antikanker dilakukan dengan uji antioksidan dengan metoda DPPH
serta dilanjutkan dengan pemisahan dan pemurnian dengan kromatografi kolom dan
kromatografi lapis tipis preparatif, karakteristik senyawa hasil isolasi secara
fisikokimia dengan spektrofotometri UV-Vis dan spektrofotometer IR (Gritter et al, 1991).
METODOLOGI PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian
Penelitian
ini telah dilaksanakan pada bulan Maret sampai bulan Mei 2012 di Laboratorium
Penelitian Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Bhakti Pertiwi Palembang, di
Laboratorium Kimia Bahan Alam dan Laboraturium Analisa Fisiko Kimia Jurusan
Farmasi Universitas Andalas Padang.
Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan dalam penelitian
ini antara lain lumpang dan mortir, tabung reaksi, seperangkat alat destilasi
uap, plat tetes, corong pisah, EYELA rotary
evaporator SB-1000, beker gelas, gelas ukur, buret, pipet gondok, vial,
botol semprot, pengaduk kaca, erlenmeyer, timbangan analitik, timbangan neraca
1kg, seperangkat alat Spektrum UV-1700 PharmaSpec (SHIMADZU), chamber, pipa kapilar, lampu
UV-BETRACHTER (CAMAG), alat vakum, oven multi King MK 16, kromatografi kolom,
kaca masir, lumpang agate, Thermo Scientifik: Nicolet iS10 dan alat-alat gelas
lainnya.
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian
ini antara lain : simplisia folium Annona
muricata L 1 kg, kloroform, kloroforom amoniak, pereaksi mayer, H2SO4
2N 0,5 ml, etanol 96 %, serbuk Mg, HCl Pekat, aquadest, FeCl3, asam
asetat anhidrat, H2SO4 pekat, pasir bersih, norit,
metanol destilat, heksan destilat, diklormetana, destilat, etil asetat
destilat, asam asetat 5%, Na sulfat eksikatus, serbuk DPPH, plat KLT silika gel
GF254, silika gel60, penampak bercak yakni iodium, sitrus
borat, amoniak, pereaksi Dragendorff, serbuk KBr.
PROSEDUR
PENELITIAN
Pengambilan Sampel
Tumbuhan diambil dari KTO (Kebun Tanaman Obat)
Universitas Andalas, Sumatera Barat, sampel yang digunakan adalah simplisia
segar daun sirsak. Kemudian dilakukan identifikasi tumbuhan sirsak di Herbarium
Universitas Andalas.
 |
| daun sirsak |
Penyiapan Sampel
Sebanyak 1 kg sampel yang segar dari daun sirsak ini disortasi
basah yakni dipisahkan dari pengotor atau bagian yang tidak diinginkan, tahap
ini dilakukan secara manual. Setelah itu, sampel di cuci bersih untuk
menghilangkan pengotor yang masih tersisa. Kemudian sampel dirajang dengan
menggunakan pisau atau alat yang bukan logam seperti kaca atau pisau stainless steel. Proses pengeringan
tidak dilakukan karena yang diambil pada penelitian ini adalah simplisia basah
dari daun tumbuhan sirsak.
Identifikasi
Metabolit Sekunder
Pengujian fitokimia dilakukan dengan pemeriksaan alkaloid
(Culvenor And Fitzgerald, 1963), flavonoida (Simes, J.J.H., Melbourne, 1959), terpenoid,
pemeriksaan saponin, Steroid, saponin dan senyawa fenol (Simes, J.J.H.,
Melbourne, 1959). Hasil yang diperolah adalah sebagai berikut :
Tabel 1. Hasil Identifikasi Metabolit Sekunder
|
Metabolit
Sekunder
|
Pereaksi
|
Hasil
|
|
Alkaloid
|
Pereaksi
Mayer
|
+
|
|
Flavonoid
|
Mg/HCl
|
+
|
|
Fenolik
|
FeCl3
|
+
|
|
Terpenoid
|
Liebermann-Burchard
|
-
|
|
Steroid
|
Liebermann-Burchard
|
-
|
|
Saponin
|
Kocok
|
-
|
Ekstraksi dan
Fraksinasi
Daun sirsak 1 kg dalam keadaan segar yang telah dirajang lalu dimaserasi
dengan menggunakan metanol sebanyak 3x selama 4 hari ± 10 L. Kemudian disaring,
didapat ampas dan sari metanol, sari metanol diuapkan dengan rotary evaporator sehingga didapatkan
ekstrak kental yang bebas dari metanol, kemudian ditimbang didapat ekstrak
kental sebanyak 22,8 g. Setelah itu, diencerkan dengan air hanggat 300ml
kedalam ekstrak kental tadi kemudian disaring dengan kapas.
Diperoleh
fraksi air, fraksi air diambil 100 ml kemudian dilarutkan dengan asam asetat 5%
sebanyak 50 ml lalu dikocok dan dienaptuangkan, kemudian dibasakan dengan
amoniak pekat kurang lebih 10ml hingga pH 10, selanjutnya larutan difraksinasi
dengan larutan DCM 3 x 300 ml maka didapatkan fraksi diklormetana (DCM) basa,
selanjutnya disaring dengan Na2SO4 eksikatus. Fraksi
diuapkan dengan rotary evaporator
sehingga didapatkan ekstrak kering dari fraksi DCM basa dengan berat 0,1366 g.
Kemudian fraksi air yang tersisa, dinginkan, dimasukkan ke dalam corong pisah,
kemudian ditambahkan heksan sebanyak 300ml, dikocok dengan corong pisah selama
15 menit, setelah didiamkan maka akan terbentuk 2 lapisan didalam larutan
tersebut dimana bagian atas heksan dan lapisan bawah fraksi air, lapisan heksan
dipisahkan. Fraksi air kembali dikocok dengan heksan 2 x 300 ml. Kumpulan
fraksi heksan disaring dengan Na2SO4 eksikatus, kemudian
diuapkan dengan rotary evaporator,
maka akan didapatkan ekstrak kering heksan, dengan berat 1,4617g. Sisa fraksi
air, dimasukkan ke dalam corong pisah, kemudian ditambahkan DCM sebanyak 300
ml, dikocok dengan corong pisah selama 15 menit, setelah didiamkan maka akan
terbentuk 2 lapisan didalam larutan tersebut dimana bagian atas fraksi air dan
lapisan bawah larutan DCM (Diklormetana), lapisan DCM dipisahkan. Fraksi air
kembali dikocok dengan DCM 2 x 300 ml. Kumpulan fraksi DCM, disaring dengan Na2SO4
eksikatus, kemudian diuapkan dengan rotary
evaporator, maka didapatkan ekstrak kering DCM, dengan berat 1,1087g
Kemudian sisa fraksi air,
dimasukkan ke dalam corong pisah, kemudian ditambahkan etil asetat sebanyak 300
ml, dikocok dengan corong pisah selama 15 menit, setelah didiamkan maka akan
terbentuk 2 lapisan didalam larutan tersebut dimana bagian atas larutan etil
asetat dan lapisan bawah fraksi air, lapisan etil asetat dipisahkan. Fraksi air
kembali dikocok dengan etil asetat 2 x 300 ml. Kumpulan fraksi etil asetat
disaring dengan Na2SO4 eksikatus, kemudian diuapkan
dengan rotary evaporator, maka
didapatkan ekstrak etil asetat kering, dengan berat 2,074 g
Identifikasi Flavonoid dan alkaloid dengan KLT
Tujuan
melakukan identifikasi flavonoid dan alkaloid dengan KLT preparatif adalah
untuk mengetahui pada ekstrak kering mana yang mengandung flavonoid dan
alkaloid.
Identifikasi Flavonoid dengan KLT
Ekstrak kering dilarutkan sedikit dengan pelarut
masing-masing lalu ditotolkan pada plat KLT silika gel F254 dengan
ukuran panjang 5 cm dan lebar 1 cm. Fase gerak yang digunakan ialah asam asetat
5%: air (1:9) dalam 10 ml dan DCM metanol (8:2). Fase gerak dimasukkan dalam chamber lalu dijenuhkan, masukkan KLT
yang sudah ditotol biarkan terjadi elusi, kemudian diangkat plat KLT dengan
menggunakan pinset sebelum batas atas plat keringkan. Setelah kering ditotolkan
FeCl3 atau sitrus borat dengan menggunakan kapas lalu pelat dilihat
di bawah lampu UV, positif flavonoid ditunjukkan bercak warna hitam atau kuning
pada plat (Harbone, J. B., 1987).
Identifikasi Alkaloid dengan KLT
Ekstrak kering dilarutkan sedikit dengan pelarut
masing-masing lalu ditotolkan pada plat KLT silika gel F254 dengan
ukuran panjang 5 cm dan lebar 1 cm. Fase gerak yang digunakan ialah campuran
metanol: larutan ammonia 25% (200: 3) dalam 10 ml dan DCM: Metanol (8:2) dalam
10ml. Fase gerak dimasukkan dalam chamber
lalu dijenuhkan, dimasukkan KLT yang sudah ditotol biarkan terelusi. Diangkat
KLT dengan menggunakan pinset sebelum batas atas plat keringkan. Setelah kering
ditotolkan pereaksi Dragendorff dengan menggunakan kapas lalu plat dilihat di
bawah lampu UV. Positif alkaloid ditunjukkan bercak warna jingga dengan latar
belakang kuning. Selain fase gerak diatas bisa juga digunakan fase gerak
campuran metanol: diklormetana (Djamal, 2010).
Tabel 2. Hasil Identifikasi
Senyawa Metabolit Sekunder dengan KLT Silika Gel GF254dan Pengujian dengan Sianidin Test
|
Fraksi
|
Alkaloid
(P. Dragendorff)
|
Flavonoid
|
Fenolik
(FeCl3)
|
|
|
(Sitrus borat)
|
Sianidin Test
|
|||
|
n-Heksan
|
-
|
-
|
-
|
-
|
|
DCM
|
+
|
-
|
-
+
|
-
|
|
Etil
Asetat
|
-
|
+
|
+
|
|
|
DCM basa
|
+
|
-
|
-
|
-
|
Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode DPPH
Pembuatan Reagen DPPH
Serbuk DPPH ditimbang lebih kurang 9,8575 mg menggunakan
timbangan analitik dimasukkan ke dalam labu ukur 250ml dilarutkan dalam 100 ml
metanol destilat, kemudian dikocok sampai larutan homogen berwarna violet.
Kemudian metanol destilat diteteskan ke dalam labu hingga batas volume 250 ml.
Labu ditutup rapat dengan penutupnya, kemudian dikocok sampai larutan homogen
berwarna violet, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 100µM.
Pengerjaannya dilakukan ditempat yang terlindung dari cahaya.
Pengukuran Panjang Gelombang Serapan Maksimum DPPH
Larutan DPPH yang telah dibuat dipipet sebanyak 3,8 ml
dan ditambahkan 0,2 ml metanol mengunakan pipet mikro. Larutan DPPH dikocok
pelan hingga homogen dan dibiarkan selama 30 menit ditempat yang terlindung
dari cahaya. Larutan campuran DPPH dengan metanol dimasukkan ke dalam kuvet dan
diuji serapannya menggunakan alat spektrofotometri dan serapan larutan diukur
dengan spektrofotometri visibel pada panjang gelombang 400-800 nm. Maka
didapatkan panjang gelombang 515,8 nm dengan Absorbansi 0,712.
Penentuan IC50 Fraksi Etil Asetat Daun Sirsak
Pembuatan Larutan Sampel
Fraksi ekstrak kering ditimbang sebesar 10 mg (untuk DCM
dan etil asetat), dan ditimbang 0,5 mg (untuk etil asetat), di dalam vial 10 ml
yang telah dinolkan pada timbangan analitik. Setelah itu dilarutkan dengan
metanol 5 ml, vial digoyang sampai larutan uji telah homogen, metanol
diteteskan ke dalam vial hingga 10ml yang segera ditutup rapat, vial dikocok
secara bolak balik sampai larutan telah homogen secara visual. Dilakukan
pemipetan kedua sebanyak 5ml, larutan uji tersebut dimasukkan ke dalam vial
kedua dan dilarutkan dengan metanol hingga 10ml. Dilakukan pemipetan sampai
didapatkan 5 konsentrasi. Konsentrasi larutan uji yang didapatkan dari kelima
pengenceran tersebut adalah sebesar 1, 0,5,
0,25, 0,125, 0,0625,
dan 0,03125 mg/ml. Sementara DCM basa ditimbang 6 mg yang dilarutkan dalam
6 ml metanol destilat yang segera ditutup rapat, vial dikocok secara bolak
balik sampai larutan telah homogen secara visual. Dilakukan pemipetan kedua
sebanyak 3 ml, larutan uji tersebut dimasukkan ke dalam vial kedua dan
dilarutkan dengan metanol hingga 6 ml, dilakukan pengenceran sampai 5
konsentrasi, dibuat dengan konsentrasi yang sama dengan fraksi etil asetat dan
DCM.
Penentuan Aktivitas Antioksidan
Dipipet 0,2 ml masing-masing larutan
sampel dengan berbagai konsentrasi, dimasukan kedalam vial, ditambah 3,8 ml
larutan DPPH 100µM, dihomogenkan dan dibiarkan selama 30 menit ditempat gelap.
Serapan diukur dengan spektrofotometri UV-Vis
pada panjang gelombang serapan maksimum DPPH yakni 515,8 nm. Pengujian
aktivitas antioksidan dilakukan sebanyak dua kali pengulangan untuk masing-masing
konsentrasi larutan sampel kemudian dianalisa dengan regresi dan korelasi
inhibisi (I) terhadap konsentrasi
Menurut Ariyanto cit.
Armala (2009), tingkat kekuatan antioksidan senyawa uji menggunakan metode
spektofotometri dengan pereaksi radikal bebas DPPH dapat digolongkan menurut
nilai IC50.
Tabel 3. Absorbansi Sari DCM, Sari Etil Asetat dan Sari DCM Basa
Pada Berbagai Konsentarasi
|
Konsentrasi
(ppm)
|
Absorbansi
|
||
|
DCM
|
DCM
basa
|
Etil
asetat
|
|
|
1000
|
0.136
|
0.06
|
0.037
|
|
500
|
0.281
|
0.127
|
0.056
|
|
250
|
0.407
|
0.316
|
0.077
|
|
125
|
0.476
|
0.446
|
0.086
|
|
62,5
|
0.526
|
0.517
|
0.118
|
Tabel 4. Hubungan Konsentrasi Sari DCM, Sari Etil Asetat dan Sari
DCM Basa dengan Data Hasil Uji Antioksidan
|
Konsentrasi
(ppm)
|
Persen
Inhibisi Sampel
|
||
|
DCM(%)
|
DCM
basa(%)
|
Etil
asetat(%)
|
|
|
1000
|
80,899
|
91,573
|
94,803
|
|
500
|
60,534
|
82,163
|
92,134
|
|
250
|
42,837
|
55,618
|
89,185
|
|
125
|
33,146
|
37,359
|
87,921
|
|
62,5
|
26,124
|
27,388
|
83,427
|
|
Y Persamaan
|
y
= 0.057x + 26.52
|
y
= 0.067x + 32.83
|
y = 0.010x + 85.51
|
|
R2
|
R²
= 0,970
|
R²
= 0,849
|
R² = 0.824
|
Tabel 5. Hubungan
Konsentrasi Sari Etil Asetat dengan Data Hasil Uji Antioksidan
|
Konsentrasi
(ppm)
|
Absorbansi
|
Persen
Inhibisi (%)
|
Y
Persamaan
|
R2
|
|
50ppm
|
0,111
|
84,41
|
Y
= 1.651x + 0.005
|
0,993
|
|
25ppm
|
0,444
|
37,64
|
||
|
12,5ppm
|
0,569
|
20,084
|
||
|
6,25ppm
|
0,643
|
9,691
|
||
|
3,125ppm
|
0,654
|
8,146
|
Isolasi Flavonoid Fraksi Etil Asetat dengan Kromatografi Kolom dan KLT
Preparatif
Kromatografi Kolom Fraksi Etil Asetat Daun Sirsak
Isolasi senyawa dilakukan terhadap
fraksi etil asetat daun sirsak dengan menggunakan metoda kromatografi kolom,
yang sebelumnya dianalisa dengan KLT menggunakan fase diam silika gel GF 254,
fasa gerak metanol dan diklorometana (DCM) dengan perbandingan tertentu.
Sebagai penampak bercak digunakan lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm,
setelah didapatkan pelarut yang cocok untuk memisahkan komponen-komponen yang
ada dalam senyawa tersebut, selanjutnya dilakukan pemisahan secara kromatografi
kolom. Pada pemisahan awal ini pelarut yang digunakan sebagai fase gerak adalah
campuran pelarut yang memiliki perbandingan tertentu. Pelarut yang digunakan
adalah gerak metanol dan diklorometana. Fraksi etil asetat sebanyak 400mg
dikromatografi vakum cair (flash
chromatography) dengan fase diam silika gel 60 ukuran 43-60 µm dan fase
geraknya metanol dan diklorometana (DCM). Silika gel disuspensikan dengan
metanol dan diklorometana. Suspensi silika gel dimasukkan kedalam kolom berupa
tabung kaca yang ujungnya terdapat kapas dan pastikan silika di dalam kolom
menjadi padat sambil diketok-ketok dan tidak ada rongga udara. Sampel disiapkan
secara preabsorbsi dengan melarutkannya dalam metanol dan DCM. Usahakan sampel
harus benar-benar melarut pada fase gerak. Sampel yang telah larut dimasukkan
merata ke dalam kolom kromatografi kemudian dielusi dengan fase gerak yang
kepolarannya ditingkatkan secara bertahap. Pengelusi yang digunakan sebagai
berikut:
Metanol : Diklormetana 1 : 9 400ml
Metanol : Diklormetana 2 : 8 100ml
Metanol : Diklormetana 2,5 : 7,5 100ml
Fraksi yang keluar ditampung
dengan vial yang volumenya rata-rata 20ml, maka didapatkan dari perbandingan
metanol : diklormetana 1 : 9 sebanyak 27 vial, perbandingan metanol :
diklormetana 2 : 8 sebanyak 6
vial sementara perbandingan fase gerak metanol : diklormetana 2,5 : 7,5
sebanyak 6 vial. Setelah itu tiap fraksi dimonitor dengan KLT menggunakan eluen
metanol : diklormetan (2:8), (3:7), (2,5:7,5) dengan penampak bercak lampu UV
254 nm, reagennya amoniak dan sitrus borat. Fraksi dengan pola KLT yang sama
atau besar Rf nya yang sama yakni 0,75 digabung yakni pada subfraksi
vial 2-23 (1:9). Selanjutnya diuapkan dengan rotary evaporator dan ditimbang beratnya, didapat berat = 116,8 mg,
senyawa hasil kolom ini dinamakan senyawa DSK. Kemudian vial 31-33 (2:8)
digabung untuk fase gerak (3:7) dan vial 37-39 (2,5 :7,5) digabung untuk fase
gerak (5:5). Namun untuk fase gerak kolom metanol : DCM dengan perbandingan
(2:8) dan (2,5 :7,5) tidak diidentifikasi lebih lanjut.
Gambar 1. Profil KLT Hasil Elusi dari Kromatografi Kolom pada Fase
Gerak Metanol : Diklormetana (DCM) (2:8)
Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (Harborne, 1987)
Fraksi etil asetat yang telah didapatkan dari pemisahan
dengan menggunakan kromatografi kolom pada perbandingan fase gerak metanol:
diklormetana (1:9), dimana fraksi yang dikumpulkan memiliki Rf yang
relatif sama digabung kemudian diuapkan dengan rotary evaporator sehingga didapatkan ekstrak kering selanjutnya
ditimbang didapatkan berat 116,8 mg, kemudian dilakukan dilakukan pemisahan
lanjutan dengan kromatografi lapis tipis (KLT) preparatif untuk mendapatkan
senyawa yang lebih murni lagi, diambil sedikit dari ekstrak yang ada,
dilarutkan dengan metanol. Kemudian ekstrak yang telah larut ditotolkan pada
plat KLT dengan ukuran 6,5 x 6,5 cm. Bercak yang terbentuk berupa pita, dengan
menggunakan pipa kapiler. Kemudian dikeringkan dan dikembangkan dengan fase
gerak untuk KLT preparatif ini adalah metanol: diklormetana dengan perbandingan
2: 8. Plat KLT yang telah terelusi dilihat dilampu UV dengan panjang gelombang
254 nm. Maka akan terlihat bercak berupa pita, kemudian dari plat KLT ini
digunting sedikit untuk diuji penampak bercak dengan menggunakan iodium,
amoniak, sitrus borat, FeCl3, pereaksi Dragendorff. Sebagiannya
dikerok dari plat KLT, kemudian diekstraksi dengan fase gerak yang sama, lalu
disaring dengan kaca masir. Hasil ekstraksi diuapkan dengan rotary evaporator sehingga didapatkan
ekstrak kering hasil pemisahan dengan kromatografi preparatif disebut dengan
senyawa DS dengan berat 5,2 mg. Kemudian dihitung Rf nya maka
didapatkan 0,7. Senyawa hasil isolasi berupa serbuk amorf berwarna
putih-oranye.
Gambar
2. Profil KLT Preparatif
Tabel 6. Hasil Pengujian
Metabolit Sekunder dari KLT Preparatif Pada Fase Gerak Metanol : Diklormetan
(2:8) dengan Penampak Warna
|
Metabolit Sekunder
|
Penampak Bercak
|
Hasil
|
|
Alkaloid
|
Pereaksi Dragendroff
|
-
|
|
Flavonoid
|
Sitrus Borat
|
+
|
|
Fenolik
|
FeCl3
|
+
|
Gambar 3. Hasil Pengujian
Metabolit Sekunder dari KLT Preparatif Pada Fase Gerak Metanol : Diklormetan
(2:8) dengan Penampak Warna
Pengujian Antioksidan dari Hasil Elusi Fraksi
Kromatografi Kolom
Ekstrak etil
asetat hasil dari fraksi kromatografi kolom (Senyawa DSK) dilakukan pengujian
antioksidan dengan menggunakan metode DPPH, untuk menentukan IC50 dari
senyawa yang sedikit lebih murni.
Pembuatan Reagen DPPH
Serbuk DPPH ditimbang lebih kurang 9,8575 mg menggunakan
timbangan analitik dimasukkan ke dalam labu ukur 250ml kemudian dilarutkan
dalam 100 ml metanol destilat, kemudian dikocok sampai larutan homogen berwarna
violet. Kemudian metanol destilat diteteskan ke dalam labu hingga batas volume
250 ml. Labu ditutup rapat dengan penutupnya, kemudian dikocok sampai larutan
homogen berwarna violet, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 100µM.
Pengerjaannya dilakukan ditempat yang terlindung dari cahaya.
Penetuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum DPPH
Larutan DPPH yang telah dibuat dipipet sebanyak 3,8 ml
dan ditambahkan 0,2 ml metanol mengunakan pipet mikro. Larutan DPPH dikocok
pelan hingga homogen dan dibiarkan selama 30 menit ditempat yang terlindung
dari cahaya. Larutan campuran DPPH dengan metanol dimasukkan ke dalam kuvet dan
diuji serapannya menggunakan alat spektrofotometri dan serapan larutan diukur
dengan spektrofotometri visibel pada panjang gelombang 400-800 nm. Maka
didapatkan panjang gelombang 515,0 nm dengan Absorbansi 0,914.
Penentuan IC50 dari Fraksi Hasil Kromatografi
Kolom (Senyawa DSK)
Pembuatan Larutan Sampel
Senyawa DSK ditimbang sebesar 5 mg
di dalam vial yang telah dinolkan pada timbangan analitik. Setelah itu
dilarutkan dengan metanol 2,5 ml, vial digoyang sampai larutan uji telah
homogen. Metanol diteteskan ke dalam vial hingga 5ml yang segera ditutup rapat.
Vial dikocok secara bolak balik sampai larutan telah homogen secara visual.
Dilakukan pemipetan kedua
sebanyak 2,5 ml, larutan uji tersebut dimasukkan ke dalam vial kedua dan
dilarutkan dengan metanol hingga 5ml. Dilakukan pengenceran hingga konsentrasi
kelima. Konsentrasi larutan uji yang didapatkan dari kelima pengenceran
tersebut adalah sebesar 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,03125 dan 0,015625
mg/ml. Senyawa pembanding digunakan vitamin C, dengan konsentrasi yang sama
dengan larutan uji.
Penentuan Aktivitas Antioksidan
Dipipet 0,2 ml masing-masing larutan sampel dengan
berbagai konsentrasi, dimasukan kedalam vial, ditambah 3,8 ml larutan DPPH
100µM, dihomogenkan dan dibiarkan selama 30 menit ditempat gelap. Serapan
diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang serapan maksimum
DPPH yakni 515nm. Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan sebanyak satu kali
pengujian untuk masing-masing konsentrasi larutan sampel. Aktifitas antioksidan
sampel ditentukan oleh besarnya hambatan serapan radikal DPPH melalui
perhitungan persentasi inhibisi serapan DPPH, kemudian dihitung IC50 dengan
menggunakan persamaan linier yang didapatkan dari perbandingan garis lurus
antara konsentrasi dan persen inhibisi. Kemudian dilakukan perbandingan dengan
senyawa pembanding vitamin C.
Tabel 7. Hubungan
Konsentrasi Senyawa DS dengan Data Hasil Uji Antioksidan
|
Konsentrasi
(ppm)
|
Absorbansi
|
Persen Peredaman
(%)
|
Y Persamaan & R2
|
|
250
|
0,038
|
95,842
|
Y = 0.218x + 44.42
R² = 0.961
|
|
125
|
0,193
|
78,884
|
|
|
62.5
|
0,39
|
57,330
|
|
|
31.25
|
0,458
|
49,890
|
|
|
15.625
|
0,495
|
45,842
|
Tabel 8. Hubungan Konsentrasi Vitamin C dengan Data Hasil Uji
Antioksidan
|
Konsentrasi
(ppm)
|
Absorbansi
|
Persen Peredaman
(%)
|
Y Persamaan & R2
|
|
250
|
0,029
|
96,827
|
y = 0.237x + 44.49
R² = 0.849 |
|
125
|
0,115
|
87,417
|
|
|
62,5
|
0,344
|
62,363
|
|
|
31,25
|
0,423
|
53,719
|
|
|
15,625
|
0,576
|
36,98
|
Spektrofotometri UV-VIS dan Spektrofotometri IR
Identifikasi Spektro UV-Vis dari Hasil KLT Preparatif
Sebanyak 1 mg senyawa DS dilarutkan dalam 5ml metanol,
kemudian diukur serapannya dengan Spektrofotometri dengan panjang gelombang 200
sampai 800 nm. Dari pengukuran akan diketahui λ maks senyawa flavonoid.
Gambar 4. Spektrum UV-VIS Senyawa DS dari Daun Sirsak (Annona muricata L.) dalam Metanol
Identifikasi flavonoid murni dengan Spektrofotometri IR
Sebanyak 1 mg senyawa DS
flavonoid/antosianin murni digerus dengan KBr murni dalam lumpang, kemudian
pelet KBr. Dari spektrum IR dapat dilihat bilangan gelombang semua pita serapan
yang muncul, data spektrum IR senyawa kemudian dibandingkan dengan data
referensi flavonoid.
Gambar 5. Spektrum IR Senyawa DS Daun
Sirsak (A.muricata L.) dengan Pelet
KBr
HASIL DAN
PEMBAHASAN
Telah dilakukan isolasi sebuah senyawa antioksidan dari daun sirsak (Annona muricata L.) yang diharapkan
tidak menyebabkan penyakit parkinson. Proses ekstraksi dilakukan secara
maserasi menggunakan pelarut metanol. Sari metanol diuapkan dengan rotary evaporator, kemudian diencerkan
dengan air dan kemudian difraksinasi
berturut-turut dengan dengan n-heksan, diklormetana, etil asetat kemudian
dengan diklormetana dalam suasana basa. Identifikasi senyawa metabolit sekunder
pada masing-masing fraksi menggunakan kromatografi lapis tipis seperti terlihat
pada Tabel 1 dan pengujian antioksidan dengan metode spektrofotometri VIS
menggunakan pereaksi radikal DPPH seperti terlihat pada Tabel 2. Pemisahan
senyawa pada fraksi aktif antioksidan dengan kromatografi kolom dengan fasa
diam silika gel 60 dan fasa gerak campuran diklormetana : metanol
dengan kepolaran meningkat dan KLT preparatif dengan fasa diam Silika gel GF254,
dengan fasa gerak campuran diklormetana : metanol (2:8). Identifikasi senyawa
hasil isolasi dilakukan dengan metoda spektrofotometri UV dan Spektrofotometri
IR.
Uji aktifitas antioksidan ekstrak diklormetana, etil asetat, diklormetana
dalam suasana basa menunjukkan IC50 berturut-turut 411,929, 30,282,
dan 256,3ppm. Sedangkan identifikasi dengan KLT ekstrak diklormetana,
etilasetat, diklormetana dalam suasana basa menunjukkan kandungan kimia
golongan alkaloid, flavonoid dan fenolik.
Fraksi etil asetat yang mengandung flavonoid dan tidak mengandung alkaloid
selanjutnya diisolasi dengan KLT preparatif dengan fasa diam Silika gel60
dan fasa gerak campuran diklormetana : metanol (8:2). Pita kromatogram dengan
Rf 0,75 dikerok dan diekstraksi dengan metanol, kemudian diuapkan dengan rotary evaporator dan didapatkan suatu
senyawa flavonoid berupa serbuk amorf dengan warna putih kekuningan. Spektrum
UV flavonoid hasil isolasi dalam etanol menunjukkan λ maksimal 223 nm dan 279,5
nm. Sedangkan hasil spektrum IR menunjukan adannya gugus OH, gugus C-H, gugus
C=O, gugus C=C, gugus C-O. Pengujian antioksidan senyawa hasil isolasi dengan
metoda spektrofotometri VIS dengan pereaksi radikal DPPH menunjukkan IC50
25,6 ppm sedangkan IC50 dari senyawa pembanding vitamin C memberikan
IC50 8,25 ppm.
Berdasarkan pengujian dengan penampak bercak sitrus borat, fraksi etil
asetat mengandung senyawa flavonoid sedangkan dari data pola spektrofotometri
UV dan spektrofotometri IR yang dihasilkan, kemudian dibandingkan dengan
literatur, senyawa hasil isolasi termasuk senyawa flavonoid diduga golongan
flavanon, dan memiliki aktivitas antioksidannya kuat.
KESIMPULAN
1.
Dari pemeriksaan
pendahuluan metabolit sekunder pada daun sirsak (A.muricata L.) menunjukan hasil positif alkaloid, flavonoid,
fenolik.
2.
Hasil maserasi 1 kg
daun sirsak (A.muricata L.) segar
dengan metanol didapatkan ekstrak kental 22,8 g. Ekstrak kental difraksinasi
dengan n-heksan, diklormetana, etil asetat dan diklormetana dalam suasana basa,
didapatkan ekstrak kering berturut-turut 1,4617, 1,1087, 2,074 dan 0,1366g.
3.
Dari pengujian
aktivitas antioksidan pada fraksi diklormetana, etil asetat dan diklormetana
dalam suasana basa, didapatkan IC50 berturut-turut 411,929, 30,282,
dan 256,3 ppm. Sehingga didapatkan fraksi etil asetat yang memiliki aktivitas
antioksidan kuat (<50 ppm)
4.
Fraksi etil asetat
daun sirsak pada pengujian pendahuluan antioksidan memiliki aktivitas paling
tinggi dari fraksi yang lain. Dengan IC50 = 30,282ppm. Sedangkan
Fraksi etil asetat daun sirsak yang telah lakukan pemisahan dengan kromatografi
kolom (senyawa DSK) memiliki aktivitas antioksidan kuat (<50 ppm) dengan IC50
= 25, 6ppm, sedangkan IC50
vitamin C=23,25ppm.
5.
Berdasarkan hasil
identifikasi yang diperoleh dari spektrofotometri UV dan IR, bahwa flavonoid
senyawa DS dari daun sirsak (A. muricata
L.) diduga senyawa golongan flavanon yang memiliki panjang gelombang maksimum
223 nm dan 279,5nm dan memiliki gugus fungsi OH, C=O, C=C, C-H, dan gugus
fungsi C-O.
DAFTAR PUSTAKA
Armala, M. M.. 2009. Daya Antioksidan Fraksi Air Ekstrak Herba Kenikir (Cosmos
caudatus H. B. K.) dan Profil KLT, Skripsi, 39, Fakultas Farmasi
Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta.
Djamal, Rusjdi. 2010. Prinsip-Prinsip Dasar Isolasi dan Identifikasi. Padang: Universitas
Baiturrahman.
Culvenor, C. C. J, dan J. S, Fitzgerald. 1963. A Field Method for Alkaloid Screening of
Plant. J. Pharm Sci.
Gritter,R.J., J.M. Bobbit, dan A. E. Schwarting.
1991. Pengantar Kromatografi, Terbitan
kedua, diterjemahkan oleh Kosasih padmawinata. Bandung : ITB.
Harborne, J.B.. 1987. Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Menganalisa Tumbuhan.
Terjemahan K.Padmawinata. Edisi II. ITB Press. Bandung: Halaman 76
Ideasanti. 1995. Telaah Senyawa Fenolik Daun Sirsak, Annona muricata L.,
Annonaceae. Dept. Farmasi ITB: Bandung.
McLaughlin.2008. Paw-paw and Cancer
Annonaceous Acetogenin from Discovery to Comercial Products, Department of
Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, School of Pharmacy and
Pharmaceutical Sciences, Purdue University, 71(7):1311–1321.
Mohanty, Sambeet et al, Annona muricata (Graviola): Toxic or therapeutic, Natural Product
Communications, 2008;3(1):31-33).
Simes, J. JH, et al. 1959. An Australian Phaytochemical Survey Saponins and Easter Australian
Flowering Plant, Commonwealth Scintific and Industrial Research Organization.Australia
Youngson, Robert. 2005. Antioksidan : Manfaat Vitamin C dan E bagi
Kesehatan. Jakarta : Arcan.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar